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Rekombinante Spinnenseidenproteine assemblieren unter milden wässrigen Bedingungen und Einfluss von Phosphationen zu β-Faltblatt-reichen Fibrillen. Dieser Nukleationsmechanismus kann zur Ausbildung von Protein-Nanohydrogelen verwendet werden, d.h. immobilisierte, vernetzte Strukturen mit Quellverhalten.

Katalytisch aktive Proteine (Enzyme) benötigen kontrollierte Umgebungsbedingungen, um ihre Aktivität zu erhalten, insbesondere im immobilisierten Zustand. Spinnenseidenprotein-basierte Nanohydrogele ermöglichen eine vielfältige kovalente oder nicht-kovalente Einbindung von Enzymen in kontrollierter, schützender Mikroumgebung. Darüber hinaus lassen sich die Nanohydrogele auf verschiedene Oberflächen, wie beispielsweise Goldelektroden und elektro-gesponnene Vliesstoffe, übertragen und eröffnen somit ihre potenzielle Anwendung im Bereich der Biosensorik.

Das rekombinante Spinnenseidenprotein eADF4(C16) zeigt eine Assemblierung von Proteinfibrillen mit hohem Anteil an β-Faltblatt-Sekundärstrukturen. Die Bildung der Fibrillen entsteht durch Selbstassemblierung, welche durch Phosphat-Ionen getriggert wird. Dieser Mechanismus dient als Vorlage für den Aufbau immobilisierter Hydrogele mit Schichtdicken im Nanometerbereich, die in biomedizinischen Anwendungen eingesetzt werden können.

Projekt 1: Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften

Die Struktur und Funktion von Nanohydrogelen wurden bislang noch nicht systematisch untersucht. Aus diesem Grund konzentriere ich mich in diesem Projekt auf die Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Nanohydrogelen, beispielsweise Quellung, Nanomechanik, Selbstheilung und Interaktion mit Proteinen, um eine maßgeschneiderte Anwendung der Nanohydrogele zu ermöglichen.

Projekt 2: Zellmustererzeugung mittels Photolithographie

Nanohydrogele können mittels Click-Chemie mit DNA-Strängen funktionalisiert werden. In diesem Projekt werde ich eine photoinduzierte Click-Reaktion nutzen, um DNA-Aptamere in definierten Mustern zu immobilisieren und so eine räumlich kontrollierte Bindung unterschiedlicher Zelltypen an die Nanohydrogele zu ermöglichen. Die erzeugten Zellmuster können als zweidimensionale Modelle zur Nachbildung von Mikrogewebestrukturen dienen.

Projekt 3: Nanohydrogele als Wirkstoffdepots

DNA-Origami-Strukturen sind vielversprechende Wirkstoffträger, da sich Krebsmedikamente in ihre DNA-Struktur einbauen lassen und sie diese gezielt in die Zellen bringen können. Hier sollen DNA-modifizierte Nanohydrogele entwickelt werden, die die Speicherung und bedarfsgerechte Freisetzung der DNA-Origami-Strukturen ermöglichen. Dieses System könnte in der Behandlung von Krebs, beispielsweise in der Augenheilkunde, Anwendung finden.

Nukleinsäuren können sich selbst mit einer Präzision und Vorhersagbarkeit zu vielen verschiedenen Nanostrukturen zusammensetzen, die unter den natürlichen und synthetischen Materialien ihresgleichen sucht. Eines der besten Beispiele für diese hohe Genauigkeit ist die Faltung von DNA-Origami. Auch rekombinante faserförmige Proteine assemblieren von alleine zu Nanofibrillen, supramolekulare Strukturen aus dicht gepackten Kreuz-ß-Faltblattstrukturen. Solche Fibrillen, die typischerweise einen Durchmesser von 10 nm und eine Länge von Hunderten von Nanometern aufweisen, besitzen eine hohe physiko-chemische Stabilität sowie eine hohe mechanische Steifigkeit. Sie sind daher gut geeignete Gerüste für die Herstellung geordneter Nanomaterialien.

Um die Vorteile sowohl von Protein- als auch von DNA-Materialien zu nutzen, kombinieren wir rekombinante Spinnenseidenproteine und Nukleinsäuren zu Hybridmaterialien. Deren grundlegende Eigenschaften werden charakterisiert, um neue Anwendungen in der Materialforschung zu realisieren. Im Fokus stehen dabei chemische Modifikationen und Konjugationen der Bausteine, Anordnungen von Proteineinheiten bei der Hybridisierung von DNA und die entsprechende Morphologie und Struktur der konjugierten Fibrillen. Die spezifische DNA-Hybridisierung wird ausgenutzt, um die Nukleation der Fibrillen in hierarchische Strukturen auf Oberflächen auszulösen. Durch Kombination von Soft- und Photolithographietechniken mit den DNA-Hybriden kann die Selbstorganisation der supramolekularen Strukturen in 2D und 3D räumlich definiert werden. Unsere Technologie ermöglicht die Bildung von fibrillären Nanohydrogel-ähnlichen Netzwerken in beliebig geformten Mikrostrukturen. Mit chemisch gekoppelten DNA-Aptameren können Enzyme, Wachstumsfaktoren oder sogar ganze Zellen spezifisch und funktional gebunden werden.

Abb. 1: Selbstorganisation von DNA-Protein-Hybridmaterialien in Lösungen (bottom-up). Die Spinnenseidenanteile in den Hybriden, die durch chemische Konjugation mit DNA hergestellt wurden, wurden durch gezielte DNA-Hybridisierung räumlich zu verzweigten Strukturen angeordnet und selbstorganisiert zu Bändern, die sich durch DNA-Wechselwirkung bei bestimmten Temperaturgradienten weiter zu Mikrofächern organisierten.

Abb. 2: Strukturierung der Hybridmaterialien mittels DNA-gesteuerter Hybridisierungstechnologie. Mit capture-DNA modifizierte Oberflächen wurden mit Hilfe der Mikro-Kontaktdrucktechnologie an definierten Stellen mit komplementären DNA-Spinnenseide-Konjugaten verbunden. Die immobilisierten Konjugate dienten als Keimzellen für das Wachstum von Seidenfibrillen auf der Oberfläche.

Abb. 3: Mikrostrukturierte Nanohydrogele. a) Photolithographisch bearbeiteter Positiv-Ton-Photoresist mit Mikrovertiefungen für die räumlich definierte Protein-Selbstorganisation auf der Oberfläche; b) AFM-Scans der selbstorganisierten faserigen Mikrostrukturen nach Entfernung des Photoresists; c) immobilisierte faserige Netzwerke zeigen Nano-Hydrogeleigenschaften wie Quellung und Aufweichung der Oberfläche; d) Zellen, die spezifisch auf den DNA-modifizierten Spinnenseiden-Mikrostrukturen über eine vordefinierte DNA-Zell-Interaktion immobilisiert wurden.

Perspektive

Die Verarbeitung oder Strukturierung von Spinnenseidenproteinen und deren biofunktionalisierten Hybriden zu einer Plattform auf Nanohydrogelbasis ermöglicht die Integration verschiedener Funktionen in immobilisierte Fibrillennetzwerke. Unter Ausnutzung solcher biomolekularer Werkzeuge sollen komplexere Muster erforscht werden, die mehrere Funktionen beinhalten, wie z. B. konjugierte Enzyme, Aptamere oder Goldnanopartikel, die in 1D entlang der wachsenden Fibrillen und in 2D-Mustern auf Oberflächen aufgebracht werden. Die gleichzeitige Möglichkeit der spezifischen Immobilisierung lebender Zellen und der programmierbaren Strukturierung von Nanohydrogelen bietet eine Plattform mit großem Potenzial für die Entwicklung von zahlreichen biologischen und biomedizinischen Anwendungen in der regenerativen Medizin sowie der Zelltrennung und -analytik.

Abb. 4: Universelle Plattform eines nanofibrillären Gerüsts aus Spinnenseidenprotein für multifunktionale Oberflächenmodifikationen